High-resolution imaging at the cellular and subcellular levels in flattened whole mounts of early zebrafish embryos

We describe a rapid and sensitive method for high-resolution imaging at the cellular and subcellular levels in the whole-mount zebrafish embryo. The procedure involves fixing and staining the embryo, followed by deyolking and flattening it under a cover slip, to produce a planar mount that is 20 to 100 µm thick. Such a flattened whole mount allows imaging with a spatial resolution of ~500 nm in the x-y plane and does not require the use of embedding, sectioning, confocal microscopy, or computational deblurring procedures. We can resolve all individual nuclei and chromosome sets in the embryo, up to the late gastrula stage (10 000 cell stage). In addition, older embryos (through the segmentation stage) can also be examined, with the preservation of significant morphological detail. Because of its ability to resolve subcellular detail, the flattened whole-mount method can provide significant biological information beyond what can be obtained from conventional (three-dimensional) whole mounts. We have used the flattened whole-mount method to study subcellular events related to progression through the cell cycle or to apoptosis, in cells of the early zebrafish embryo. A specific DNA-binding dye (Hoechst 33258) or an antibody against a chromosomal protein (histone H1) was used to stain the nuclei of individual cells in the embryo. This allowed us to determine the spatial positions of all the individual cells, and also their stages in the cell cycle. A terminal transferase (TUNEL) assay was used to detect apoptotic cells. This combination of specific stains allowed us to study the behaviors of groups of cells in situ, within the developing zebrafish embryo. Nous décrivons une méthode rapide et sensible pour obtenir des images à haute résolution de cellules et d'éléments subcellulaires d'embryon de poisson-zèbre monté en entier. Il faut d'abord fixer et colorer l'embryon, puis enlever le vitellus et aplatir l'embryon sous une lamelle, ce qui produit une préparation plate de 20 à 100 µm d'épaisseur. Un tel montage de l'élément entier aplati permet d'obtenir des images ayant une résolution spatiale d'environ 500 nm dans le plan x-y et ne nécessite pas d'inclusion, de préparation de coupes, de microscopie confocale ou de correction d'image par ordinateur. Nous pouvons résoudre chacun des noyaux et des groupes de chromosomes dans l'embryon jusqu'à la fin du stade gastrula (10 000 cellules). De plus, des embryons plus vieux (en cours de segmentation) peuvent également être étudiés, car des détails morphologiques importants sont préservés. À cause de sa capacité de résoudre les détails subcellulaires, la méthode de montage de l'élément entier aplati fournit plus d'informations biologiques importantes que les montages d'élément entier classiques (tridimensionnels). Nous avons utilisé la méthode de montage de l'élément entier aplati pour étudier les événements subcellulaires se produisant dans les cellules d'embryon précoce de poisson-zèbre au cours du cycle cellulaire et de l'apoptose. Les noyaux des cellules de l'embryon ont été colorés à l'aide d'un colorant se liant spécifiquement à l'ADN (Hoechst 33258) ou d'un anticorps dirigé contre l'histone H1, une protéine chromosomique. Cela nous a permis de déterminer la position de toutes les cellules dans l'espace et la phase du cycle cellulaire où elles se trouvaient. Une méthode de marquage des extrémités de brins d'ADN par transférase (TUNEL) a été utilisée pour détecter les cellules en apoptose. Cet ensemble de colorations spécifiques nous a permis d'étudier le comportement de groupes de cellules in situ, à l'intérieur de l'embryon de poisson-zèbre en développement.